Serial EM を使った JEM1400 plus での Cryo-EM

Quantifoil R2/2 grid
Glow discharge
Sample preparation, blotting
Bakeout からの取り出し
  1. Evacuent を押して真空を破る
  2. しばらく待つ
  3. ホルダー下部の空気抜くところを締めてチューブを抜く
  4. ホルダーを抜く
JEM1400plusの準備
  • 電顕上部の穴から漏斗で液体窒素を入れて冷やす。このとき一度入れてしばらく待つと沸騰してその後おちつく。落ち着いた後に再度注ぐ
クライオホルダの冷やし方
  1. ホルダーの台座にホルダーを設置する。このときホルダー先端のグリッド収納部のカバーはしたまま(Bake outのときからカバーされているはず)
  2. Bake out の器械の温度センサーを装着
  3. 先端側を最初に冷やす。ロートをホルダー台座にある穴の中に差し込み液体窒素を注ぐ。これ以降注ぎすぎるとホルダーと台座の間にあるゴムのパッキンが凍ってしまい壊れるので、パッキンより下までしか注がないように注意する
  4. 突沸するまで待って、突沸後に再度補充。液体窒素が落ち着くまで待つ
  5. ホルダー根元を冷やし始める。根元に液体窒素を注いで突沸を待つ。突沸後すれすれまで入れて蓋をする
  6. ホルダー先端の台座、液体窒素が一度枯れるまで待つ。そのご再度充填。そのころになったら落ち着いているはず、作業開始
グリッドのホルダーへの設置
  1. グリッドケースをホルダー台座に設置する。大きなピンセットでつかんで移動
  2. グリッドケースをねじを緩めておく。
  3. ホルダー先端のガードを根本を捜査して開ける
  4. グリッドケースからグリッドを取り出してホルダー先端に設置、このとき使用するピンセットはしっかりと冷やしてから使用
  5. グリッドを抑えるグリッドカバーを専用の道具を使って取り付ける。道具は根元を回すと先端の出っ張りの出し入れが出来る。出っ張りを納めた状態(片方だけ出っ張ってる状態)でグリッドカバーを引っ掛けて、根元を回して、グリッドカバーを固定
  6. グリッドカバーをグリッドの上、ホルダー先端に置き設置、根元を回して道具のみ回収
  7. ホルダーのグリッドガードを付ける
ホルダーの出し入れ
  1. そのままの角度だと液体窒素がホルダーから漏れるので少し傾ける
  2. 20°に設定した+TX ボタンを押して傾ける。傾けた後は穴にあるへこみが9時の方向にあったのが10-11時方向になっているはず
  3. 戻すときは TX Neutralボタンを押して戻す
  4. ホルダーをホルダー台座ごと電顕の側まで持ってくる
  5. 手早くグリッドを電顕に差し込む。
  6. vacumを引き始める
  7. vacumが引き終わり真空のランプが緑になるのを二回繰り返す。二回の後にホルダーを入れ始める
  8. ホルダーを抑えながら　TEM centerで Neutral ポジションに戻す。戻るとちょうど一段階押し込める位置に来る。
  9. 通常のホルダー挿入作業と同様の手順でホルダーを挿入
  10. Filamentを ONにする
Serial EM set up full montage
  1. 最初は念のためグリッドガード付けた状態で開始
  2. Low mag modeにして Spot size 5、Brightness のねじを右に回しきってビームが弱い状態にしておく
  3. グリッドガードを開ける
  4. Spot size, brightnessをいじって蛍光板を見ながら適当な明るさにする
  5. x50位の倍率でViewで一枚撮影。明るさ、撮影倍率が適切か確かめる。明るすぎる場合は暗くする
  6. Full montageを撮る。ツールバーのNavigator からNavigatorを呼び出し。
  7. そのご Setup full mongtage を選択
  8. ピクセルサイズを直す (たしか1940 => 1928)。MRCかTIFFかは好みなので変えたければ変える
  9. SerialEM 画面、右部にある MontageのセクションでStartを押してMontageの撮影、作製を行う
  10. Pop up がでてきてdo you want to make a new —— となるのでyes
  11. Navigator のwindow内、sec0 xxxx.idocをダブルクリックで全体像が表示される
  12. Navigator のAdd point を選択、撮影したい点をクリックで選択、いくつか選択したらStop adding で終了
  13. Go to XY で目的の場所に移動
Serial EM 使い方
  1. Low dose modeでlow mag時以外の全ての作業を行う
  2. Macro Z by V で高さ合わせ
  3. Autofocusで focusの倍率でのfocus合わせ + defocus
  4. Standard focus
  5. ZeroIS
  6. focus時のビーム位置は continuous updateのチェックをクリックした状態でいじると覚えてくれる
  7. Navigatorを用いて見たい点を Add Marker で追加
  8. もし見たい点と実際の場所がずれている場合は Shift to Marker で位置を修正
Serial EM を使ってグリッド全体のmontageを撮影
Serial EMによる撮影
  1. Navigatorで目的の部分に移動
  2. viewボタンで撮影
  3. Macro Z by V で高さ合わせ
  4. 大体場所を決めて高さが合ったら autofocus で focus時の高さあわせとdefocus (設定可能、-2.0くらい)
  5. ビームの位置が中心にあり、かつ適切な大きさにする
  6. record を押して撮影
終了時
電顕からホルダーを抜く
ホルダー台に戻して専用の道具でグリッドを外す
外したらホルダーに温度センサーを取り付けて真空引き台座に差し込む
Bake out start
0℃以上、理想的には室温以上にしてから Evacを押して真空を引く
電顕側はACD heatを行う
絞りを全て開放する
ホルダーは抜いたまま
ACD heatの道具を左上の液体窒素を入れていた穴にセット
ACD heat ON